RASPROSTRANJENOST
LT je utvrdzen u mnogim zemljama.  To je opasna bolest kokosi prisutna u podrucjima velike koncentracije peradi u  SAD-u Europi i Austrliji. U Hrvatskoj LT nije zabiljezen (1998.).

ETIOLOGIJA

Klasifikacija. LT virus (LTV) ima sve karakteristike herpesvirusa. To je kubican virus, omotan (enveloped) s lipoproteinskim dvoslojem, Osjetljiv je na eter. Svrstan je u familiju Alphaherpesviridae s  virologiskom nomenklaturom Gallid herpesvirus 1.

Morfologija. Elektronskim mikroskopom se mogu uociti icosahedralne* cestice iste strukture kao herpes simplex virus. Dijametar virona* varira od 80 do 100 nm. Capsida* im ima icosahedralnu simetriju i sastoji se od 162 izduljene suplje capsomere*. Kompletna virusna cestica, zajedno s nepravilnim omotcen (envelope*) koji okruzuje nucleocapsid-u, ima dijemetar 195-250 nm.

Kemijski sastav. LTV je DNA virus s specificnom tezinom DNA od 1.704 kg/l (g/ml). Molekulrna masa DNA virusa je oko 108.  Genom virusa ima 2 izomerna oblika. Udio gvanin-citozin je 45% sto je vise no u vecine drugih animalnih herpesvirusa. 4 glavna glikoproteina, molekularne mase 205, 115, 90 i 60 kD su lokalizirani na virusu, ali i na stanici inficiranoj s virusom. Naravno, kao takvi predstavljaju glavne imunogene LT virusa.

Replikacija virusa. Umnazanje LTV-a je isto kao umnazanje virusa herpes simplex i pseudorabies. Virus se absorbira na povšinu stanice i potom u stanicu ulazi pinocitozom. Enzimi domacina uniste ovojice virusa (envelope i kapsida) tako da  DNA ostaje slobodna i migrira u stanicni nukleus. Prvi dokazi novih LTV komponenti se mogu uociti u nukleusu za otprilike 12 sati.
Kompletna nukleokapsida migrira kroz nuklearnu membranu stanice; kasnije dobiva lipoproteinski omotac (envelope). Kompletne virusne cestice se akumulirju unutar vakuolarne membrane u citoplazmi. Vakuole ispunjene virusima migriraju do staicne membrane i stapajuci se s membranom oslobadzaju viruse u ekstracelularni prostor. U normalnim uvjetima najveca koncentracija LT virusa  se javlja u traheji.

Rezistancija LT virusa na kemiske i fizicke agente. Cestice LT virusa su osjetljive na lipoliticke agente, toplinu, i razlicite dezinficijense. Virus ce biti unisten prilikom izlaganja:
1. eteru kroz 24 sata,
2. 55oC kroz 15 min,
3. 38oC kroz 48 h.
Ipak treba biti oprezan jer pojedini sojevi virusa su opasni i nakon 56oC kroz 60 min. U traheji pilecih leseva na tempereturi 13-23oC virus je opasan i nakon 10 dana. 3%-na otopina krezola ili 1% otopina NaOH i Na-karbonata ce inaktivirati LT virus za manje od 1 min.

Klasifikacija sojeva LT virusa. Izolirani su brojni sojevi LT virusa razlicite virulencije. Usprkost velikom broju sojeva, LT virus je antigeno vrlo homogen. Naravno, tu postoje odredjene iznimke, a treba racunati i s mogucim mutacijama.
Odre?ivanje patogenosti  pojedinih sojeva virusa je glavni prakticni problem. Trenutno se za tu svrhu rabi ponajviše biološki sistem za odre?ivanje patogenosti LT virusa na osnovi indeksa mortaliteta kokošjih embrija. Kao alternativna metoda se moze rabiti analiza DNA uzoraka uz ograicenje endonukleaza. Uporaba kloniranih DNA fragmenata u reciprocnoj DNA:DNA hibridizaciji puno obecava u razlikovanju sojeva LT virusa, ali ta metoda zahtjeva daljnji razvoj.

Umnazanje virusa in vitro. LT virus se moze uzgajati na embriju kokošjeg jaja. Virus tvori tamne mrljice na chorioallantois-noj* membrani. Te tockice su zapravo proliferetivne i nekroticne lezije. Tockice imaju tamnje rubove koji okruzuju centralno smjesteno podrucje nekroze. Mogu se zamjetiti najranije 48 sati nakon inokulacije. Broj i velicina tockica raste linearno s vremenom. Embrijo ugiba za 2 do 12 dana poslije inokulacije. LT virus se umnaza na kulturi stanica jetre, pluca ili bubrega kokošjeg embrija, kulturi stanica kokošje jetre, odnosno korioalantoisnoj membrani. Kultura fibroblasta  kokošjeg embrija je kontraindicirana.
Prve patološke promjene na kulturi stanica se mogu opaziti  4-6 sati nakon inokulacije. S povecanjem broja cestica virusa citoplazma postaje tamnja i stanica natice, kromatin mjenja svoj polozaj u stanici, nukleus postaje okruglji. Stapanje citoplazmi dovodi do stvaranja multinuklearnih stanica. Intranuklearne inkluzije se mogu uociti najranje 12 sati nakon inokulacije. Kolicina im je najveca 36 sati nakom inokulacije. Velike citoplazmatski vezikule se rezvijaju u  multinuklearne stanice i postaju sve bazofilnje kako stanica degenerira.

PATOGENEZA I EPIZOOTIOLOGIJA

Prirodni i eksperimentalni domacini.  Kokoši su primarni prirodni domacini LT virusa. Iako bolest zahvaca sve generacije, najkarakteristicnji se simptomi mogu uociti u odraslih ptica. Umnazanje virusa je ograniceno na respiratorno tkivo. Stoga se viremia normalno ne javlja. Iako rijetko, od LT mogu oboliti i fazani, mladi purani. LT virus je  izoliran i iz  traheje pauna. Cvorak, vrabac, vrana, stari purani, patke, golubovi, biserke su otporne na LT virus. Embriji purana i kokoši su osjetljivi na LT virus. Jaja pataka su naznatno osjetljiva, a ostala jaja nisu osjetljiva na LT virus.

Sirenje virusa. Ulazna vrata za LT virus su gornji dijelovi dišnog trakta i oci. Ingestija takodzer moze biti nacin infekcije. Ipak, prilikom ingestije virus u?e u organizam ponajcesce tako što iz usta dospije na epitel nosa. Izvor infekcije je puno cesce bolesna zivotinja sa simptomima nego klinicki ozdravljen nosioc virusa.
Nakon infekcije gornjeg dijela dišnog trakta slijedi intenzivno umnazanje virusa. LT virus je prisutan u sekretima i tkivu traheje samo prvih 6-8 dana. Izvantrahealno sirenje LT virusa do ganglija trigeminalnog zivca (n. trigeminus) 4-7 dana nakon infekcije trheje  je uoceno u 40% kokosi inficiranih s virulentnim australskim sojem LT virusa. Reaktivacija latentnog virusa iz ganglija n. trigeminus-a (ganglion of trigeminal nerve) 15 mjeseci nakom vakcinacije je zabiljezena u Njemackoj. Primjeceno je ponovljeno izlucivanje LT virusa iz latentno inficiranih kokosi nakon stresa izazvanog premjestanjem kokosi iz jednog proizvodnog prostora u drugi i pocetkom reprodukcije.
Klinicki inaparentni oblik infekcije LT virusom je glavni nacin opstanka LT virusa. Kada su s laringealnim i trahealnim sekretom inokulirane neotporne (neimunizirane) kokosi uocen je udio prikrivnih nosioca virusa  od 2% u periodu do 16 mjeseci nakon pojave bolesti. Ovisno o soju virusa i drugim faktorima taj udio moze biti i preko 50%. Isto tako, kod slabo patogenih sojeva LT virusa moguc je spontani nestanak LT virusa za 7 do 20 tjedana. Tretman imunosupresivnim lijekovima se nije pokazao uspjesnim u reaktivaciji latentnih LT virusa.
Mehenicki se virus moze siriti kontaminiranom opremom, prostorom i leglom.
Prenos LT virusa u jaje ili iz jaja van nije zabiljezen. Kokosji embriji inficirani s LT virus-om ugibaju prije valjenja. Sam virus se inaktivira u roku od 24 sata na tempereturi od 37 C.

Period inkubacije, morbiditet i mortalitet. Znaci bolesti se jevljaju 6-12 dana  nakon prorodnog izlaganja uzrocniku. Intratrahealna ekspozcija rezultira kracim inkubacionim periodom os 2-4 dana.
Epizootski oflik bolesti se siri brzo u neotpornih kokosi, zahvacajuci 90-100% jata. Mortalitet varira od 5 do 70% (prosjek 10-20%). U benignim slucajevima bolesti mortalitet moze biti ispod 2%.

Simptomi (signs) LT infekcije. Karakteristican znak akutne infekcije je nosni iscjedak i vlazni hropci  na koje se nadovezuje kasljanje i soptanje. Jasna dyspnea i  ekspektoracije krvavo obojenog mukoznog sadrzaja je  karakteristicno za ozbiljnije oblike bolesti.
Blazi enzootski oblik LT ima simptome:
smanjena produktivnost, smanjena nesivost, vlazne oci, conjuctivitis,  i oteknuce stanica infraorbitalnih sinusa, perzistantan nosni iscjedak i hemoragiski conjuctivitis.
Tijek bolesti varira ovisno o opsegu lezija. U pravilu, vecina kokoski se oporavi u 10-14 dana, ali i ekstremi 4 tjedna su moguci.

Opseg lezija. Lezije se javljaju mahom u trahealnom i laryngealnom  tkivu. Promjene tkiva variraju od mukoidne upale na pocetku bolesti do degeneracije mukoze, rezultirajuci s nekrozom i hemoragijama u kasnijem stadiju. Iskasljvanje deskvamiranog epitelnog tkiva i krvi mogu se javiti tijekom jakog kaslja i konvulzivnog disanja. Moze se javiti i siranje upale duz bronha pa u pluca i zracne vrece. Edem i kongestija epitela konjuktiva i infraorbitalnih sinusa mogu biti jedine uocljive lezije u manje patogenih sojeva.

Histopatologija. Mikroskopske promjene variraju ovisno o stadiju bolesti. Elektron-mikroskopski se mogu uociti prve promjene u jezgri stanica mukoze  tijekom formiranja viralnh kapsida. Slijedi migracija virusa kroz jezgrinu membranu u citoplazmu. Pritom nukleokapsida biva omotana s lipoproteinskim omotacem (envelope) koji predstvlja dio jezgrine membrane. Kompletne virusne cestice se u citoplazmi nakupljaju unutar vakuola. Velika masa virusnih cestica u citoplazmi rezultira mutnim nabreknucem stanice. To se moze zamjetiti pod svjetlosnim mikroskopom kao rana stanicna promjena.
Kako stanicne promjene napreduju, stanica raste, gubi cilije, postaje edematozna. Limfociti, histociti, i plazma stanice migriraju u mukozu i submukozu za 2-3 dana. Potom stanicna destrukcija uzrokuje odvajanje mukoze od submkoze. Krvarenja tome slijede.
Intracelularne inkluzije se javljaju unutar epitelnih stanica najranje 12 sati nakon inokulacije. Prilikom trazenja inkluzija paznju valja posvetiti odgovarajucem fiksativu (fixative).

Imunitet. Otpornost kokosi na LT virus slijedi prirodnu infekciju ili vakcinaciju. Trajnost rezistencije uzrokovane prirodnom infekcijom moze trajati  godinu dana ili vise. Takav produzeni period imunosti moze biti rezultat subklinickih infekcija koje se javljaju u jatu. Reservoar virusa za nemanifestne infekcije moze biti specifican endemski nosioc u jatu ili neki drugi izvor.
Imunitet izazvan vakcinacijom razlicito traje. Imunitet moze poceti blijediti najranje 8-15 tjedana nakom vakcinacije. U pravilu se racuna da imunitet traje 15-20 tjedana nakon vakcinacije. Potreba revakcinacije je dosta upitna (ekonomski).
Infekcija LT virusom izaziva brzu produkciju antitijela koja mogu neutralizrati virus. Vec 7 dana nakon infekcije ta se antitijela mogu dijagnosticirati u serumu. Najvecu koncentraciju dosezu ~ 21. dan nakon infekcije. Kako su to antitijela za LT virus, mogu se uociti i u trachealnoj sluzi. Humoralni imuni odgovor, iako vezan na infekciju, nije primarni mehanizam zastite od infekcije LT virusom. To objasnjava zasto u pravilu ne postoji podudarnost izmedzu titra serumskih antitijela i imunog statusa jata. Stanicna imunost je glavna obrana od LT virusa. Stoga bursectomizirane ( sa izvadzenom burzom) ili imunosupresivima tretirane kokosi, koje ne mogu razviti humoralni imuni odgovor, mogu razviti punu otpornost nakon LT vakcinacije. Otpornost je moguce postici i ubacivanjem imunih stanica slezene otporne zivotinje u mlado pile.
Iako se antitijela za LT virus prenose s nesilice na potomstvo putem jaja, ta antitijela ne nose otpornost na infekciju, niti mogu interferirati s vakcinom. Pilici mladzi od 2 tjedna ne odgovaraju na vakcinaciju tako dobro kao starje ptice. Ipak, pilici se mogu vakcinirati vec sa 1 dan starosti.
Imunitet se u pilica starjih od 2 tjedna razvija vrlo brzo. Djelomicna zastita se javlja  nakon 3-4 dana, a potpuna nakon 6-8 dana nakon vakcinacije ili izlaganje LT virusu.

Dijagnoza. LT se ne moze sa sigurnoscu klinicki dijagnosticirati. Iako  su neki znakovi akutnog LT karakteristicni, vecina znakova  je zajednicka s mnogim drugim respiratornim bolestima peredi.
Akutni LT, s tipicnim kasljam,  ekspulzijama (expulsion) krvavog sadrzaja i visokim mortalitetom moze se lako dijagnosticirati. Kod ostaih oblika bolesti laboratorijske pretrage se trebaju izvrsiti prije ostalih kontrolnih postupaka. Virus se moze izolirati iz tkiva traheje i pluca nakon inokulcije na koksjem embriju, traheji ili infraorbitalnim sinusima neimunih kokoi ili nakon inokulacije kulture stanica.
Utvrdzivanje intranuklearnih inkluzija u trahealnom ili konjuktivalnom tkivu obojenom po Giemsi moze posluziti za dijagnozu LT-a. Inkluziona tjelesca se mogu uociti samo u prvoj fazi bolesti (1-5 dana) jer u drugoj fazi bolesti nekroza i deskvamacija uniste zahvaceno epitelno tkivo. Upotreba kiselog fiksativa je vazna za demonstraciju inkluzija. To treba pazljivo raditi jer se samo u 57% slucajeva mogu dokazati inkluzije.
Pirozok je rezvio metodu brze dijagnostike inkluzija; tkivo se polozi u Carbowax, razreze i oboji. Materijal je spreman za pregled nakon 3 sata.
Brza identifikacija virusa u tkivu traheje moze biti ucinjena uz pomoc testa florescentnih antitijela (imunoflorescencija). Pritom su anti-LT virus globulini oznaceni nekom florescirajucom tvari. Ukoliko antigeni postoje tada se ta florescirajuca antitijela nece moci isprati jer su vezana na antigene. Tako je moguce dokazati LT virus 2-14 dana nakom inokulacije.
Intratrahealna  inokulacija neotpornih i imuniziranih pilica s trahealnim eksudatom ili tkivnom suspenzijom iz sumljivih ptica moze biti dobar dijagnosticki postupak. Brza dijagnostika moze biti napravljena elektronskim mikroskopom. Pritom treba u strugotinama traheje prepoznati cestice herpesvirusa. Trenutno je ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) najbolje metoda za brzu detekciju LT virusa. ELISA je jednako tocna, ali brza od testa florescirajucih antitijela ili gel percipitacionog testa za detekciju LT virus antitijela u  traheji.
Za dobru izolaciju LT virusa iz sumljivog primjerka nuzno je to obaviti na svijezem materijalu. To znaci unutar 6 dana od infekcije (vidi patogenezu). Takodjer, materijal treba sto hitnije dopremitii u laboratorij, ponajbolje u vlaznom ledu.
Izolacija LT virusa se postize inokulacijom suspenzije trahalnog eksudata, suspenzije trahealnog ili plucnog tkiva u korioalantoisnu mambranu 9-12 dana starog kokosjeg embrija. Staice kokosjeg embrija ili stanice bubrega kokoske su kulture izbora za izolaciju LT virusa. Dvije pasaze kroz te kulture su dovoljne za detekciju LT virusa.

Serologija.  Virus Neutralizacija (VN) je bila koristena za demonstraciju prisustva LT antitijela. Danas se VN antitijela uglavnom dokazuju pokusom u kulturi stanica koristeci jednoslojne kulture smjestene u tube ili petrijeve zdijelice. Raziciti oblici ELISA reakcijese se rabe za dokazivanje LT antitijela. Direktnom poredbom 4 najrasprostranjena seroloska testa za dokazivanje antitijela LT virusa  se dobiva:
1. ELISA, virus neutralizacija i indirektna imunoflorescencija (florescent antibody test) su dobre metode za odredzivanje  nivoa antitijela.
2. ELISA se preferira za orjenteciske pokuse.
3. Agar-gel imunodifuzioni test je prikladan, ali nize kvalitete od prethodno navadenih testova.

Terepija. Ne postojo lijek koji moze smanjitio opseg lezija i ublaziti znakove bolesti.
Ukoliko je dijagnoza postavljena dovoljno rano vakcinacija neinficiraih ptica moze inducirati odgovarajucu zastitu prije no sto infekcija nastupi.

PREVENCIJA I KONTROLA

Menagmentni postupci.  Kako LT virusna infekcija uglavnom za sobom ostavlja latentno inficirane ptice – rezervoare virusa, izrazito je vazno izbjeci mjesanje vakcinirnih ili ozdravljenih pilica s neimuniziranim pilicima. Upotrebom odgovarajucih sanitetskih metoda cemo prevenirati infekciju neimuniziranih pilica kontaminiranom opremom ili prostorima.
Vaznost smjestaja karantene i higijene u prevenciji kretanja (potencijalno kontminiranog) osoblja,  servisera i drugog personala, hrane, opreme,  i ptica su osnova  dobre prevencije/kontrole  LT-a. Mjere kontrole za pse i glodavce takodzer treba postivati. Protiv latentnih infekcija se takodzer traba boriti jer nanose znatne stete.
Za kvalitetnu kontrolu LT je potrebna suradnja drzavnih institucija i industrije. Takav pristup, korektno primjenjen bi uklonio potrebu za sveobuhvatnom uporabom LT vakcine. U peradnjacima gdje se bolest pojavila oporavljena jata se trebaju staviti u karantenu koliko je potrebno. U pravilu je dovoljno 2 tjedna od posljednjeg klinickog znaka LT-a zapazenog u jatu.

Imunizacija. Vakcinacija je odgovarajuca metoda za razvoj otpornih kokosi. Kako vakcinacija moze rezultirati i latentnim nosiocima – rezervoarima virusa (koji mutira?!), preporuceno je da se vakcina koristi samo u zemljopisnim podrucjima gdje je bolest endemskog karaktera. Odgovarajuce agencije se trebaju kontaktirati kako bi se odredilo da li je u tom podrucju potrebno vakcinirati i s cime.
LT virus je atenuiran pasazama na kulturama stanica ili kokosjim embrijima ili pasazama  folikula perja u pilica.. Time je dobiven slabo enzootski soj koji je sposoban izazvati odgovarajuci imuni odgovor. Uporaba atenuiranih vakcina prevenira (onemogucava) uporabu virulentnih sojeva u mnogim podrucjima. Virulentni sojevi LT vakcine se trebaju primjenjivati uz  opomenu na potrebne mjere opreza jer latentni nosioci – rezervoari virusa se javljaju u vecini jata gdje se takve vakcine upotrebljavaju.
Imunizacija se prvo provodila namjernim izlaganjem prilikom unosenja inficirane ptice u neimunizirano jato. Pojedini su autori (1934.) predlagali unos neatenuiranog virusa kroz kloaku (per rectum). Od tada efikasna vakcinacija pilica se izvodi aplikacijom vakcina atenuiranih LT virusa bilo u infraorbitalne sinuse, bilo intranazalnim ukapavanjem, inokulaijom u folikul pera, ukapavanjem u oko, ili oralnom aplikacijom putem vode za pice. Kvaliteta vakcinacije per os ovisi o kontaktu LT virusa s epitelom nosne supljine tijekom konzumacije vode.
Aplikacija vakcine  putem spraja je jako  popularna kao sredstvo brze masovne aplikacije. Ipak, paziti treba jer ukoliko su kapljice premalene postoji mogucnost da penetriraju duboko u respiratori sistem. Sojevi LT vakcine koji su dovoljno blagi a opet dovoljno dobri antigeni trebaju biti brzo razvijeni i licencom specificirani kao vakcina za sprej aplikaciju. Ostali sojevi LT vakcine se ne smiju upotrebljavati za sprej aplikaciju jer mogu imati nezeljene posljedce (mortalitet mladih pilica...).
Paznju valja posveteti procedurama vakcinacije, kako bi svaka tehnika osigurala odgovarajucu imunizaciju. Iako je oralna aplikacija (per os) najednostavnja, najpodloznja je greskama. Pobrinuti se treba da dobra kolicina virusa dospije do svakog pilica kako bi vakcinacija bila uspjesna.

PAZLJIVO TREBA PROCITATI PROIZVODZACEVA UPUTSTVA ZA SKLADISTENJE, RAZRJEDZENJE, RESUSPENZIJU I APLIKACIJU VAKCINE!

Oprez je potreban  kada druge zive vakcine primjenjujemo u isto vrijeme kao LT virus. Npr. vakcina za Newcastle-sku bolest u pilica starih do 5 tjedana znatno oslabljuje imuni odgovor na LT vakcinu.
Jos se vijek dosta istrazuju inaktivirane LT vakcine. stoga postoji mogucnost da, ukoliko istrazivanje urode plodom, LT pocnemo kontrolirati inaktiviranom vakcinom.

Rjecnik*
CAPSIDa ( kapsida, lat. capsa, ae, f, kutija); proteinska ovojnica koja stiti nukleinsku kiselinu virusa. Moze biti helical-ne ili icosahedral-ne simetrije. Sastoji se od podjedinica – capsomera.
CAPSOMERA (kapsomera) je podjedinica od kojih je sastavljena capsida.
CHORIOALANTOISNA MEMBRANA; ekstraembriona struktura dobivena sjedinjenjem choriona i alantoisa. U sisavaca tvori placentu, a u ptica plileze na ljusku jaja.
ENVELOPE (starofranc.enveloper – smotati); lipoproteinski dvosloj koji okruzuje capsidu pojedinih virusa. Virus je stice prilikom pupanja kroz stanicnu membranu stanice domacina. Lipidi se u potpunosti preuzimaju od domacina a proteini su odredzeni kodom virusa.
ICOSAHEDRAL; geometrisko tijelo s 20 ploha i 12 vertikala.
NUCLEOCAPSIDU (nukleokasida) cine nukleinske kiseline virusa i bjelancevinska ovojnica virusa (kapsida)
VIRON; (viralna particula) virusna cestica, je nukleinska kiselina (DNA ili RNA) umotana u capsidu.

Home

Stranicu priredio: Vjekoslav Hlede
vhlede@vef.hr